细胞冻存是一个关键技术，旨在通过将细胞置于低温环境中，以有效降低细胞代谢率，进而实现细胞的长期保存，便于后续实验或临床应用。细胞冻存一般遵循慢冻原则，这一方法使细胞逐步脱水，避免因大冰晶形成而导致细胞损伤。

冻存原理

当温度降至-70℃时，细胞内的代谢活动和酶活性几乎完全停止。低于-130℃时，细胞能够达到最佳存活率。液氮可实现细胞的长期保存。同时，采用冷冻保护剂二甲基亚砜（DMSO），其能快速穿透细胞膜，降低冰点，延缓冻存过程。DMSO还能够提高细胞膜的通透性，增加细胞内离子浓度，从而有效减少细胞内冰晶的形成，起到保护细胞的效果。

贴壁细胞冻存操作步骤

1. 预热冻存液。
2. 用PBS冲洗细胞，加入胰酶进行消化（此步骤与细胞传代相同）。
3. 消化结束后，重悬细胞，转移至无菌EP管，并在1000rpm下离心5分钟。
4. 弃去上清，加入预热的细胞冻存液，最佳细胞冻存密度为5×10^6~1×10^7/ml，一般不低于5×10^5/ml。
5. 分装完成后，拧紧冻存管盖并进行标记。
6. 将分装好的冻存管放入程序降温盒，置于-80℃冰箱过夜。
7. 将冻存管转移至液氮进行长期保存。

悬浮细胞冻存操作步骤

1. 用移液管将细胞悬液轻轻吹吸均匀，然后移入离心管。
2. 在1000rpm下离心3分钟以收集细胞沉淀。
3. 用预热的冻存液重悬细胞，最佳细胞冻存密度为3-5×10^6/ml，一般不低于5×10^5/ml。
4. 分装完成后，需拧紧冻存管盖并进行标记。
5. 将分装好的冻存管放入程序降温盒，置于-80℃冰箱过夜。
6. 最后，将冻存管转移至液氮进行长期保存。

注意事项

• 利来国际强调，细胞培养、传代和冻存操作需要严格遵循无菌技术。
• 在传代时，需适度消化，消化时间受多种因素影响，包括消化液的种类等。注意观察细胞形态变化，若出现胞质回缩或连接松散，应该立即终止消化。
• 传代应在细胞处于对数期且未达到汇合状态时进行。
• 细胞冻存液需提前配制，避免直接将DMSO加入细胞悬液中。
• 选择活力达90%以上且汇合度在80%-90%之间的对数生长期细胞进行冻存，确保状态最佳，冻存密度可根据细胞特性调整。
• 程序冻存盒、细胞冻存液、完全培养基等试剂需提前复温至室温备用。
• 冻存前保持适当消化时间，避免过度吹打、离心转速过大或离心时间过长，防止细胞损伤。
• 冻存管盖需拧紧，防止水浴复苏时水分渗入造成污染。
• 细胞不应长期存放于-80℃冰箱，切忌超三天。
• 液氮或冰箱与细胞房距离较远时，需将细胞放置在干冰或冰盒上以便运输。

采用利来国际的细胞冻存技术，将为细胞保存与实验提供可靠的保障，确保科研工作的顺利推进。